Криоконсервация спермы крупного рогатого скота; оптимизированные процессы замораживания для минимизации криоповреждений

Доктор Эва Хельд, Minitub GmbH, Перевод Затворницкой И.А.

Влияние криоконсервации на сперматозоиды. Физические и физиологические процессы.

Криоконсервация сперматозоидов неизбежно уменьшает жизнеспособность и фертильность спермы из-за повреждений, возникающих на клеточном уровне. Поэтому процесс замораживания должен быть понятен и оптимизирован для того, чтобы свести к минимуму эти повреждения. Хотя существует несколько гипотез, остаются непонятными внутренние молекулярные механизмы, ответственные за снижение фертильности в течение хранения in vitro. Процедуры охлаждения и замораживания приводят к ряду физических изменений во внешней среде клеточной суспензии, таких как вода и движение растворенного вещества (Vishwanath V., 2000).

Тремя основными факторами, вызывающими криоповреждения любой клетки, являются: осмотический стресс/дегидратация, окислительный стресс и формирование внутриклеточного льда. Для поддержания жизнеспособности при замораживании, сперматозоиды должны преодолеть различные изменения осмотических и окислительных состояний. Кроме негативного воздействия на осмотические изменения, формирование внутри- и внеклеточного льда, и производство реактивных форм кислорода, процесс замораживания неблагоприятно воздействует на подвижность, изменение липидной фазы, целостность мембран, функции митохондрий, целостность ДНК, передачу клеточных сигналов и метаболизм. Эти условия могут привести к апоптозу и некротической гибели клеток (обзор Meyers S.A., 2012 AAAA Записки).

Одной из наиболее значимых причин повреждения и гибели клеток во время замораживания является формирование внутриклеточного и внеклеточного льда.

Первоначально снижение температуры вызывает замерзание межклеточной среды. Внеклеточная среда замерзает в диапазоне от -5° С до -10° С, в зависимости от электролитической концентрации. В противоположность этому, внутриклеточные жидкости и компоненты не замерзают, а переохлаждаются в этом температурном диапазоне.

Формирование внеклеточного льда приводит к увеличению местной электролитической концентрации, которая влияет на диффузию внутриклеточной воды. Это вызывает дегидратацию межклеточного пространства и приводит к сжатию клеток (Mazur P., 1984). Кроме того, замороженная сперма после оттаивания проявляет признаки спермы на продвинутой стадии капацитации, даже если сперматозоиды до замораживания были только в начале капацитации (Medeiros и др., 2002).

Этапы охлаждения. Критические аспекты.

Как правило, протокол замораживания делится на три этапа: охлаждение от +5° С до -5° С, начало кристаллизации льда, также называемое кристаллизация, и охлаждение от -5° С до -130° С. До процесса замораживания эякулят должен быть охлажден до +5° C и уравновешен при этой температуре. Ряд исследований прошлых десятилетий показали, что фаза охлаждения эякулята от +30° С до +4° С имеет решающее значение для подвижности и жизнеспособности спермиев после оттаивания (Robbins и соавт. 1976, Woelders и соавт., 1998). В частности, в диапазоне между +20° C и +15° C наблюдались температурозависимые структурные изменения в мембранах плазмы (Hammerstedt и др., 1990).

Уже в 1957 году, наблюдали самый высокий необратимый коэффициент после 12-часовой фазы уравновешивания от +30° С до +5° C (Graham и соавт., 1957). В 1976 году Ennen и др. сравнил периоды уравновешивания в диапазоне от 2 до 18 часов. Самая высокая подвижность после оттаивания наблюдалась в диапазоне от 4 до 10 часов. Дальнейшие эксперименты показали, что период уравновешивания в течение 18 часов дает лучшие результаты, чем 4-часовой период, в отношении подвижности семени крупного рогатого скота после оттаивания при использовании разбавителя на основе молока (Foote R.H. и др., 2002).

Охлаждение клеток до точки их замерзания и выше не обязательно приведет к замораживанию образцов в точке уравновешивания замораживания, когда они подвергаются переохлаждению, формированию внутриклеточного льда и клеточной дегидратации. При температуре от -5° С до -10° С образование льда происходит во внеклеточной жидкости, в то время как внутриклеточная жидкость остается переохлажденной. Для того, чтобы поддерживать химическое равновесие между внутри- и внеклеточной жидкостями, клетки обезвоживаются. В этот критический период, скорость охлаждения имеет большое значение: она должна быть достаточно медленной для обеспечения достаточной клеточной дегидратации, но и достаточно быстрой, чтобы заморозить оставшуюся внутриклеточную жидкость до того как клетки подвергнутся воздействию гиперосмотических состояний в результате дегидратации (Medeiros и др., 2002).

Следовательно, криоповреждение клетки происходит, когда скорость охлаждения либо слишком медленная, либо слишком быстрая. При слишком медленной скорости охлаждения криоповреждение основано, главным образом, на «эффектах раствора», таких как накопление высоких концентраций электролитов внутри клетки и сильная дегидратация клеток. При высокой скорости охлаждения криоповреждение обусловлено, в основном, недостаточной дегидратацией и образованием внутриклеточного льда (Mazur и др., 1972) (рис. 1).

На начальном этапе замораживания возникают изменения энергии, которая доступна для преобразования в теплоту внутри образца. Так как жидкости имеют более высокую внутреннюю энергию, чем их твердая фаза, происходит повышение температуры, когда высвобождается так называемая скрытая теплота кристаллизации. Высвобождение этой скрытой теплоты кристаллизации наблюдается в виде резкого повышения температуры, с последующим образованием так называемого плато замораживания, до тех пор, пока скрытая теплота кристаллизации не будет выведена из образца.

Некоторые исследователи показали, что продолжительное плато замораживания вредно для выживаемости сперматозоидов, т.е. сокращение этого плато улучшало фертильность сперматозоидов быка (Parkinson and Whitefield 1987).

Оптимизация скорости охлаждения

Mazur и др. 1972, предположил, что оптимальной скоростью охлаждения является скорость настолько быстрая, насколько это возможно, чтобы избежать «эффектов раствора», но и достаточно медленная, чтобы клетки могли обезводиться в достаточной степени, во избежание образования внутриклеточного льда. Эти конкурирующие явления имеют характерный вид перевернутой буквы «U» – кривая скорости охлаждения по сравнению с кривой выживаемости (рис. 2).

Этот график показывает, что при медленной скорости охлаждения «эффекты раствора» являются преобладающими факторами, провоцирующими криоповреждение. При высокой скорости охлаждения криоповреждение происходит, главным образом, из-за формирования внутриклеточного льда. Комбинация этих двух эффектов означает, что будет иметь место кривая выживаемости и оптимальной скорости охлаждения в форме перевернутой буквы «U», что сводит к минимуму как «эффекты раствора», так и формирование внутриклеточного льда.

Принцип TurboFreezer

Исходя из вышеизложенного, очевидно, что регулирование нуклеации и обеспечение температурной компенсации за счет энергии, которая доступна для преобразования в теплоту приводит к улучшению жизнеспособности клеток после оттаивания. Таким образом, целесообразно использовать морозильное оборудование с контролируемой скоростью. Температурная компенсация обеспечивается автоматизированным снижением температуры камеры, что инициирует нуклеацию и впоследствии восполняет высвобождение скрытой теплоты кристаллизации. Это также доказало свою эффективность в том, чтобы избежать различной степени переохлаждения соломинок замораживаемой партии, намеренно вызывая замерзание в момент, когда образцы охлаждаются на несколько градусов ниже их точки уравновешивания замерзания.

Несмотря на данные исследования, которые были хорошо известны в течение многих десятилетий, большинство процессов замораживания соломинок со спермой с контролируемой скоростью, используемых сегодня в коммерческих установках, не в состоянии обеспечить однородную скорость охлаждения во всех соломинках, замороженных за один цикл. Причина состоит, в основном, в неопределенном и широком диапазоне температур в морозильной камере и в силе охлаждения, которая не является достаточно мощной, когда высвобождается скрытая теплота кристаллизации.

TurboFreezer разработан для удовлетворения этих важных факторов: четыре горизонтально расположенных вентилятора обеспечивают мощный поток паров азота, который нагнетается горизонтально через стойки соломинок. Предопределенная скорость потока паров в сочетании с точно регулируемой температурой, приводит к равномерному охлаждению и замораживанию образцов во всей партии соломинок.

Исключительная и уникальная способность TurboFreezer удалять скрытую теплоту кристаллизации немедленно, как только она будет высвобождена, приводит в результате к плато замерзания с чрезвычайно короткой продолжительностью.

Ни один другой морозильник не обеспечивает этой функции. TurboFreezer может восстановить температуру во всех соломинках целой замораживаемой партии в течение менее 1 минуты. Это в значительной степени более равномерно и гораздо быстрее, чем в обычных морозильных камерах (рис. 3).

Обнадеживающие результаты текущих полевых испытаний, изучающих корреляцию замораживания спермы крупного рогатого скота с использованием TurboFreezer и его влияние на фертильность, будут опубликованы в ближайшее время.